Particle Metrix

ZetaView® F-NTA 테트라스파닌 검출 키트를 이용한 EV 다운스트림 공정의 정확한 물질 수지

With위드인스트루먼트 2025. 5. 13. 15:40

 

ZetaView® F-NTA 테트라스파닌 검출 키트를 이용한
EV 다운스트림 공정의 정확한 물질 수지

Accurate Mass Balance of EV Downstream Processing using
Zetaview® and F-NTA Tetraspanin Detection Kit


Authours : Melanie reininger, Claudaia Lindner, Dr. Ingrid Hartl,

Dr. Christina Klasen, Dr. Roland Prielhofer and Dr. Klaus Graumann

 

 

A Collaboration of

 

 

개요

입자 정량화와 관련하여 세포 외 소포(EV)에 대한 후속 공정 모니터링은

어려운 것으로 입증되었습니다. 이러한 문제는 입자 안정성에 영향을 미치는

전단력(Shear forces), 최적화되지 않은 제형(Fomulations), 무엇보다도 혈청 또는

인간 혈소판 용해물(hPL)과 같은 복잡한 구성 요소에서 유래한 배지 유래 응집체의

존재로 인해 발생할 수 있습니다.

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Phoenestra GmbH 사는 혈청 및 hPL이 없는 배양 배지와 완만한 정제 방법을 사용하여

입자 물질 수지를 표시하고 중간엽 기질 세포(MSC)에서 유래한 EV 공정의 현실적인 수율을

계산할 수 있습니다. Particle Metrix GmbH 사와의 협력을 통해 다운스트림 공정 과정에서

테트라스파닌(Tetraspanin) 양성 입자의 상대적인 증가를 확인할 수 있습니다.

 

실험 방법

MSC/TERT 배양 상층액은 EVscale™ 기술을 사용하여 관류(Perfusion) 모드에서

연속적으로 수확됩니다. 적응용배지(CM, Conditioned Medium)는 추가 처리 전까지

-80℃에 보관합니다. 침전물을 제거하기 위해 2~4㎛ 컷오프의 완만한 심층 여과 단계를

수행합니다. 회수율을 높이기 위해 필터를 완충액(Buffer)으로 세척하여 농도 계수(CF)를

0.8로 만듭니다. 이어서 저전단 멤브레인 펌프와 분자량 컷오프(MWCO)가 300kDa인

중공 섬유 모듈을 사용하여 접선 유동 여과(TFF)를 수행합니다.

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이 단계에서 적응용배지는 농축되고 6개의 다이어볼륨(Diavolume)으로 완충액을

교환하여 교환율을 98% 이상, CF를 3~4로 만듭니다. 입자 농도를 더욱 높이기 위해

추가적인 스핀 여과 단계(MWCO: 100kDa)를 적용하여 CF를 ~50으로 만듭니다.

분주(Aliquoting)하기 전에 최종 원심 분리 단계에서 처리 중에 형성된 큰 응집체와

침전물을 제거합니다. 각 단위 작업 전후에 샘플을 채취하여 나노 입자 추적 분석

(ZetaView®, Particle Metrix GmbH)을 통해 분석합니다. 산란 모드(Scatter mode,

NTA)는 총 입자 수를 정량화하는 데 사용되며, 형광 모드(Fluorescent mode, F-NTA)는

사전에 F-NTA 테트라스파닌 검출 키트 표지와 결합시켜 CD9, CD63, CD81 발현 소포를

정량화합니다.

 

 

 

Figure 1 : NTA 측정 및 공정 수율 : 서로 다른 출발 물질(다른 세포 공급원, 다른 배양법)을

사용하는 두 가지 독립적인 다운스트림 공정이 수행되고 분석되었습니다. 각 단위 공정의

입자 수율은 다음과 같습니다. 심층 여과 : ~ 90% ; TFF ~80%; 최종 농도 : 65-85%,

결과적으로 전체 공정 수율은 50-60%입니다.

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Figure 2 : F-NTA 측정 - 테트라스파닌 양성 입자 농도 : 다운스트림 공정 과정에서

테트라스파닌 양성 입자의 농축이 나타납니다.

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Figure 3 : 검출된 모든 입자(NTA)의 %에 포함된 테트라스파닌 양성 입자(F-NTA) :

다운스트림 공정 과정에서 테트라스파닌 양성 입자의 상대적인 양, 즉 EV가 증가하고

있습니다. 이는 EV가 아닌 입자들이 성공적으로 제거되었음을 시사합니다.

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요약 및 결론

나노 입자 추적 분석(NTA)은 인간 혈소판 용해물(hPL) 및 무혈청 배지와 같이 적절한

환경에서 적용하고 완만한 처리 조건과 함께 사용할 경우 입자 물질 수지 (Paricle mass

balancing)를 위해 신뢰성 있게 사용될 수 있습니다.

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F-NTA 테트라스파닌 검출 키트(F-NTA Tetraspanin Detection Kit, Particle Metrix

GmbH)를 사용한 형광 표지는 세포 외 소포(EV) 농축법의 특이성을 확인할 수 있습니다.