나노 입자 추적 분석의 원리 - NTA(Nano particle Tracking Analysis) principle

안녕하세요.

Particle Metrix GmbH 社의 국내 단독 대리점, 위드인스트루먼트입니다.

 

이번 포스팅에서는 Zetaview®의 Nano particle Tracking Analysis (NTA)의

원리에 대해 설명드리겠습니다.

 

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Nano particle Tracking Analysis (NTA)는

현탁액에서 10 ~ 2000nm 직경 범위의 나노 입자를 추적하는 분석 기술로

현미경의 설정을 통해 기존 현미경의 회절 한계 이하의 입자를 산란 모드,

형광 모드에서 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

 

나노 크기의 금속 입자부터 OMV (Outer Membrane Vesicle),

LNP (Lipid NanoParticle), Virus나 Extracellular vesicles, Exosome과 같은

biological nanoparticles까지 광범위한 적용으로 입자의 굴절률과 무관하게

NTA로 크기를 측정합니다.

 

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일반적으로 NTA 매질에 분산되어 있는 Nano particles의 농도나

크기 측정에 사용되었습니다. 또한, Zetaview®는 제타 전위 및 형광 표지가 된

바이오 나오 입자의 측정도 가능합니다.

 

이를 통해, NTA는 동일 Sample에서 모든 유형의 입자에 대해

다중 매개변수 측정을 수행하여 작업자의 시간과 샘플 양을 줄이 수 있으며

NTA 적용 범위는 무기 입자의 크기, 농도, 제타 전위부터

탄소 나노 튜브 또는 나노 버블까지 다양합니다.

 

또한, 단백질 응집체, 세포 외 입자들 (OMV, LNP, Exosome, EVs, 바이러스) 또는

Liposome과 같은 모든 유형의 바이오 나노 입자를 첨가물 없이 형광 표지로 분석할 수 있습니다.

 

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Zetaview®는 Sample Cell에 있는 입자들이 레이저에 비춰 시각화되고

입자에서 산란된 빛들은 레이저와 90˚ 각도로 배치된 sCMOS 카메라 칩에 기록됩니다.

 

 

Ultramicroscopy로 알려진 설정을 통해서 일반적인 현미경의 크기 제한 미만의

입자를 감지하고 기록할 수 있으며, 각 입자의 크기는 개별 추적에 따른 브라운 운동 분석에 의해

계산되어 크기와 농도를 동시에 확인하게 됩니다.

 

1. Size 측정 원리

 

NTA의 기본 물리적 원리로는 작은 입자가 액체에 (물, PBS, 에탄올, 생리학적 완충액 등)

분산되면 입자가 모든 방향으로 무작위 하게 움직이는데, 이를 연속상이라하고

랜덤 모션을 현상을 확산이라고 하여 확산 계수 D로 표현합니다. 보다 구체적으로 본다면,

주어진 입자의 무방향 이동은 주변 물 분자에서 입자로의 에너지 전달에 의해 발생합니다.

 

확산 계수를 결정하는 이론은 Albert Einstein에 의해 개발되었으며, 시간 간격당 입자의

움직임은 평균 제곱 변위로 기록되고 정량화됩니다.

 

차원수 (1차원, 2차원 또는 3차원)에 따라 관찰된 평균 제곱 변위, 확산 계수는

다음과 같이 계산할 수 있습니다.

 

 

Stokes-Einstein equation (확산 계수와 (kв = 볼츠만 상수, T = 온도, η = 액체의 점성,

d = diameter)의 공식)을 통해 입자의 직경 d를 계산할 수 있습니다.

 

 

감지 가능한 가장 작은 입자 크기는 입자의 산란 강도, 광학 장치의 효율성 및

카메라의 감도에 따라 다르지만, 금속 입자는 상대적으로 큰 굴절률로 10nm 크기까지

감지할 수 있습니다. 또한, EV와 같은 Nano particles는 약 1.37 ~ 1.45의 굴절률을

갖고 있어 30 ~ 50nm부터 감지가 가능합니다.

 

2. Concentration 측정 원리

 

측정 부피를 아는 경우 시야에 있는 모든 물체의 계수를 통해 농도를 결정합니다.

NTA 기술은 절대 측정으로 구분되며 입자 농도는 cm³ 당 입자 수와 면적 및 부피로

표현할 수 있습니다. 또한, 더 높은 정밀도를 위해 알고 있는 물질의 농도와 크기에 맞춰

진행할 수 있습니다.

 

 

위와 같이 Field of veiw (FOV)에 표시된 Particles의 개수와 h (Depth of focus, 약 20um),

전체 포지션의 개수를 곱하여 전체 Sample의 Concentration을 계산하게 됩니다.

 

3. Fluorescence 측정 원리

 

Membrane Staining이 되었거나 형광 표지가 된 항체로 Labeling 된 세포 외 세포는

왼쪽 그림처럼 Scatter 모드에서 확인되는 소포와 다르게 오른쪽 그림은 형광 Emission 필터를

적용하고 형광 입자만 반사시키는 광만 카메라를 이용해 특정 소포를 확인할 수 있습니다.

 

이를 통해, Scatter mode의 농도와 Fluorescence mode의 농도를 비교 분석한 

Ratio (Yield) 값을 확인할 수 있습니다.

 

 

4. Zeta Potential 측정 원리

 

단일 입자에 대한 입자 이동을 아래 식을 통해 전기영동 이동성을 계산하고

(E = 전기장, V = 입자 이동속도, μe = 전기영동 이동성)

 

 

도출된 값을 아래 식에 대입하여

( η = 액체의 점성, f(ka) = debye fuction, ε = 유전상수, ζ = Zeta Potential )

 

 

Helmholtz-Smoluchowski 식을 통해 Zeta Potential을 계산할 수 있습니다.

 

5. Subpopulation 측정 원리

 

비슷한 크기와 재료가 다른 혼합물처럼 여러 Particle이 섞인 Sample의 경우

산란 강도 및 개별 입자 대상 면적과 같은 물리적 이미지 매개변수 (Size, Intensity)를 비교하여

혼합 Sample 내 복합물의 비율을 확인하는 하위 모집단 분석으로 Sample의 이질성에

대해 더욱 자세히 확인할 수 있습니다.

 

 

6. C-NTA의 원리

 

C-NTA는 Colocalization-Nano particle Tracking Analysis의 약자로

Colocalization의 비율을 정량 분석하기 위해 형광 채널 간의 동시 전환으로

아래 그림과 같이 다른 파장의 채널 간 형광을 확인함으로써 동시에 두 개 채널에

모두 나타나는 particle들의 비율 확인이 가능합니다.

 

또한, Sample을 다시 Prep. 하거나 형광 필터를 바꿔야 하는 타사 제품들과 다르게

클릭 한 번으로 형광 파장 변경이 가능하며, 측정 중인 샘플 화면에서 원클릭으로

두 가지 이상의 형광 샘플을 동시에 촬영할 수 있는 Zetaview®만의 기능입니다.

 

 

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장비에 대한 문의 사항이 있으시면 아래 연락처로 연락 주시기 바랍니다.

감사합니다.