안녕하세요.
Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점 위드인스트루먼트입니다.
이번 포스팅에서는 EVs(Extracellular Vesicles)의 보관 온도와
그에 따른 생물학적 활성도 및 EVs에 미치는 영향을 설명 드리겠습니다.
Nano particle Tracking Analysis(NTA분석법)을 이용한
나노입자추적분석기, 나노입자추적분석시스템인 Zetaview®가 실험에 사용되었습니다.
EVs 입자들에 대한 size 또는 protein의 정량과 같은 물리적 특징은
연구가 많이 되었지만, EVs의 다양한 기능들이 면역 체계 발달, 세포 항상성과 같은
기능적인 안정성을 위한 EVs의 다양한 보관 조건이 일관된 체외 연구나 치료 연구에서
중요합니다.
인간 탯줄 정맥 내피 세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell)에
Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus(KSHV)를 감염시킨 HUVEC에서
EVs의 생산량이 감염이 안된 HUVEC보다 많이 생산되고 또한 그 EVs가
Complement system에서 Activation의 마지막 생산물인 C5b-9의 발현 양을
증가시키는 연구 결과가 있었습니다.
위와 같은 기존 연구를 바탕으로 EVs의 생물학적 활성도와 물리적 특성을 보관 온도에
따라 비교하는 실험을 진행해보았습니다.
실험 조건은 EVs를 각각 37℃, 4℃, -20℃, -70℃에서 1일, 2일, 4일, 8일, 16일, 25일까지
분석하는 조건으로 진행하였고 비교하는 실험들은 아래와 같이 실시하였습니다.
1. EVs Particle Size (diameter)
2. Concentration (particle Number)
3. Western blot (EVs target protein marker CD63, CD81)
4. C5b-9 ELISA (Complement activation)
▶ 보관 온도와 기간에 따른 입자 크기 변화 비교 ◀
Zetaview® 장비를 통해 진행한 크기 변화 비교 실혐 결과 전체 온도에서
입자 크기의 차이는 크기 않았으나, -70℃에서 다른 온도에서 보다 유의하게 입자의 크기가
줄어드는 것을 8, 16, 25일차로 시간이 더 지남에 따라 작아지는 것을 확인할 수 있었습니다.
▶ 보관 온도와 기간에 따른 입자 수 변화 비교 ◀
Zetaview® 장비를 통해 진행한 입자 수 변화 비교 실험 결과 8일차까지는
유의미한 입자 수의 차이는 나타나지 않았으나 37℃에서 8일차에 조금 감소한 결과를
확인할 수 있었으며, 16일, 25일에서는 유의미하게 감소한 입자 수를 37℃와 4℃에서
나타내며, -70℃ Sample에서는 다른 온도 보관에 비해 안정적인 것을 확인할 수 있었습니다.
▶ 보관 온도와 기간에 따른 EVs 단백질의 양 변화 비교 : (A: CD63 B: CD81) ◀
Western blot을 통해 진행한 단백질의 양 변화 비교 실험 결과 8일차까지는
각각에서 큰 차이를 보이지 않았으나, 16일차, 25일차에는 37℃에서 다른 보관 온도의
EVs보다 낮은 발현양을 나타내는 것을 확인할 수 있었습니다.
▶ 보관 온도와 기간에 따른 Complement activation의 최종산물인 C5b-9 단백 발현양의 변화 비교 ◀
생물학적 활성도를 나타내는 것을 비교한 complement activation ELISA 실험을 통해
진행한 단백질 발현 양의 변화 실험 결과 2일까지는 그 양이 큰 차이를 보이지 않았으나,
4일차부터 37℃에서 발현 양이 다른 온도에 비해 줄어 biological activtiy가 감소한 것을
확인할 수 있었으며, 시간이 더 지남에 따라 37℃의 발현 양은 감소하기 시작하여
25일차가 되었을 때에는 EVs가 없는 negative control과 발현 양이 비슷한 수준까지
떨어진 것을 확인할 수 있었습니다.
4℃의 발현되는 biological activity가 25일까지는 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었습니다.
-20℃의 경우 발현 양이 안정적으로 나타나다 16일차에서는 4℃, -70℃ sample에 비하여
유의하게 감소한 결과를 확인 할 수 있었으며, 그 격차는 25일에서 더 큰 수준치로 차이가
나는 것을 확인할 수 있었습니다.
실험의 결론으로 EVs 입자의 크기에 있어서는 온도에 따라 그렇게 큰 영향을 주지 않지만
-70℃에 보관 되어있을 경우 입자의 size가 1달동안 감소하는 경향을 확인했습니다.
EVs 입자 수를 비교하였을 때 37℃, 4℃에서 시간이 지남에 따라 감소하는 것을 확인하였고
-20℃, -70℃에서 1달동안 안정적인 경향을 확인하였습니다.
Western blot을 통한 단백 양의 비교로는 37℃에서 16일부터 단백 양이 줄어드는 것을
확인할 수 있었고 생물학적 활성도를 에서는 4℃, -70℃에서는 1달까지는 효과가 유지되어
가는 결과를 확인하였고 37℃에서는 8일차부터 감소하는 추세를 보이며, -20℃에서도
16일차부터 감소하는 결과를 확인할 수 있었습니다.
1달간 EVs 보관에 최적인 온도는 -70℃였으며 생물학적 이용에서는 4℃ 보관도 1달까지는
안정적이라고 결과를 확인할 수 있었습니다.
장비에 대한 문의 사항이 있으시면 아래 연락처로 연락주시기 바랍니다.
감사합니다^^
