Zetaview 형광 NTA(F-NTA)를 이용한 세포외 소포 순도 평가와 유세포 분석 및 TRPS와의 비교

Assessment of Extracellular Vesicle Purity Using Zetaview®

Fluorescence NTA (F-NTA) in Comparison to Flow Cytometry and TRPS

 

 

개요

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세포 외 소포(EV)는 생의학 연구, 바이오 공정 개발 및 임상 응용 분야에서 바이오마커 및 기능적 매개체로 점점 더 많이 연구되고 있습니다. EV 특성 분석에서 중요한 과제는 샘플 순도를 정확하게 평가하는 것입니다. 이는 일반적으로 사용되는 분리 방법이 단백질 응집체, 지질 단백질 또는 세포 파편과 같은 비소포 입자를 함께 분리하는 경우가 많기 때문입니다.

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표준 나노 입자 추적 분석(NTA)은 입자 크기와 농도에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 본질적으로 소포체와 비소포체 입자를 구별하지 않습니다. 그 결과, 높은 입자 수는 높은 세포외 소포의 수율로 잘못 해석될 수 있으며, 이는 분리 효율, 다운스트림 기능성 또는 샘플 간의 비교 가능성에 대한 잘못된 결론을 초래할 수 있습니다.

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형광 기반 접근법은 소포 특이적 특징을 나타내는 입자를 선택적으로 검출하여 이러한 한계를 극복하는 전략을 제공합니다. 막 염료는 막으로 둘러싸인 입자를 식별할 수 있게 해주며, CD9, CD63, CD81과 같은 테트라스파닌에 대한 항체 기반 표지는 세포외 소포에 대한 분자 특이성을 제공합니다. 따라서 산란모드 나노입자추적분석(NTA)과 형광모드 나노입자추적분석 (F-NTA)의 결합은 동일한 샘플 내에서 총 입자와 소포 하위 집단을 정량적으로 구분할 수 있습니다.

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Zetaview® 시스템을 사용한 형광 NTA를 적용하여 전체 입자 농도를 막 양성 및 테트라스파닌 양성 분획 농도와 비교하여 세포외 소포의 순도를 평가합니다. 이 접근법은 유세포 분석 (Flow Cytometry) 및 가변 저항 펄스 감지(TRPS)를 포함한 다른 기술과 비교하여 방법론적 차이점과 EV 순도 분석에 대한 실질적인 의미를 알아볼 수 있습니다.

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실험 방법

1. EV 항체 염색

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EV 표지는 F-NTA EV 테트라스파닌 검출 키트 520에 제공된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. EV 샘플 1µl를 희석된 F-NTA 테트라스파닌 EV 검출 키트 520(anti-CD9 1µl, anti-CD63 1µl, anti-CD81 1µl를 PBS 27µl에 희석) 1µl와 함께 1시간 동안 배양했습니다.

분석 전에 샘플을 PBS 998µl로 희석했습니다. 

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2. 혈장 유래 세포외 소포(Plasma EVs)의 막 염색(Membrane staining)

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막으로 둘러싸인 입자를 표지하기 위해, EV 샘플 1µl를 PBS에 1:2000으로 희석한 CellMask™ Deep Red(CMDR, Thermo Fisher Scientific) 1µl와 함께 1시간 동안 배양했습니다. 분석 전, 샘플을 PBS 998µl로 희석했습니다.

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3. 산란모드 나노입자추적분석(NTA) 및 형광모드 나노입자추적분석(F-NTA)

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측정은 Zetaview® Evolution QUATT 장비와 ZetaSphere 소프트웨어 사용하여 수행했습니다. 모든 분석에는 PMX EV PAN 염색법의 측정 설정을 적용했습니다.

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4. 세포외 소포체(Extracellular Vesicles)

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건강한 기증자로부터 얻은 인간 혈소판에서 분리한 동결 건조 엑소좀 10µg을 H2O 10µl에 재현탁하여 본 실험에 사용했습니다.

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Result a)

Result b)

Result c)

그림 1: Zetaview®를 이용한 EV 순도 분석의 대표적인 결과. 견강한 기증자로부터 채취한 인간 혈소판에서 분리한 엑소좀을 F-NTA EV 테트라스파닌 검출 키트 520과 CMDR로 염색하여 NTA 및 F-NTA 측정 a) 시료 내 모든 입자의 농도 (Scatter mode), 테트라스파닌 양성 입자의 농도(Fluorescence mode) 및 막 염색 입자의 농도 (Fluorescence mode) b) NTA 및 F-NTA 측정의 입도 분포 c) 테트라스파닌 양성 및 막성 분획의 계산된 순도

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NTA 나노입자추적분석 방법과 다른 원리 장비와의 비교

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1. 형광 나노입자추적분석(Fluorescence NTA) vs 유세포 분석(FCM)

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유세포 분석(Flow Cytometry Method)은 표현형의 세포외 소포(EV) 분석을 가능하게 하지만, 크기와 농도 측정에는 간접적인 원리가 사용됩니다. EV의 크기는 일반적으로 굴절률과 입자 기하학적 구조가 정의되어 있다고 가정하고, 보정 비드(Standard bead particles) 를 사용하여 빛 산란 강도로부터 추정됩니다.

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그러나 실리카 또는 폴리스티렌 비드와 같이 일반적으로 사용되는 보정 비드는 구성 및 광학적 특성 면에서 EV와 상당히 다릅니다. EV는 이질적인 구조와 낮은 굴절률을 나타내므로, 이러한 보정 비드를 통해 얻은 크기 추정치는 절대적인 물리적 크기가 아닌 근사치에 불과합니다.

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마찬가지로, FCM에서 EV 농도는 일반적으로 검출 영역을 통과하는 코어 스트림의 추정 부피로부터 얻어집니다. 유체역학 및 유동 안정성의 변화는 부피 측정에 추가적인 불확실성을 야기할 수 있습니다. 

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반면, Zetaview®는 외부 보정 표준물질 없이 EV의 크기와 농도를 측정할 수 있습니다. 입자 크기는 브라운 운동 분석을 통해 얻어지며, 농도는 특정 관찰 부피 내의 절대 입자 수로부터 계산됩니다. 이는 산란 및 형광 측정 모두에 일관되게 적용되어 동일한 분석 내에서 전체 입자와 표지된 EV 하위 집단을 정확하게 정량화할 수 있습니다.

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2. 형광 나노입자추적 분석(F-NTA) vs. 가변 저항 펄스 감지(TRPS)

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가변 저항 펄스 감지(TRPS)는 입자가 나노 기공을 통과할 때 발생하는 전기 저항의 일시적인 변화를 기반으로 고해상도 입자 크기 및 농도 측정을 제공합니다. 이 기술은 뛰어난 크기 식별 능력을 제공하지만, 일반적으로 고유한 분자 특이성이 부족하고 EV 하위 집단을 식별하기 위해서는 별도의 표지 또는 직교 분석이 필요합니다.

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또한, TRPS 측정은 시료를 순차적으로 분석해야 하고 측정 시간이 입자 농도, 기공 안정성 및 막힘 현상에 크게 좌우되기 때문에 비교적 시간이 많이 소요됩니다. 기공 교정 및 안정화 시간을 포함하여 시료당 일반적인 측정 시간은 20분에서 60분 정도입니다.

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Zetaview® 시스템을 이용한 형광 NTA 측정은 일반적으로 시료당 몇 분 내에 완료되며, 형광 표지를 통해 입자 크기, 농도 및 분자 종류를 동시에 확인할 수 있습니다. 이를 통해 특히 비교 연구나 품질 관리 환경에서 더 높은 처리량과 더 효율적인 워크플로우를 구현할 수 있습니다.

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논의

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본 연구 결과는 형광 나노입자추적 분석법(F-NTA)이 단일 측정에서 전체 입자 수와 소포 특이적 하위 집단을 구분함으로써 EV 순도를 정량적으로 평가할 수 있음을 보여줍니다. 산란 모드 NTA와 막으로 둘러싸인 입자 및 테트라스파닌 양성 입자의 형광 검출을 비교함으로써 전체 입자 농도에 대한 비소포성 성분의 기여도를 쉽게 식별할 수 있습니다.

 

막 염색은 막으로 둘러싸인 입자의 비율을 추정하는 데 사용될 수 있으며, EV 테트라스파닌에 대한 항체 기반 표지법은 분자 특이성을 제공합니다. Particle Metrix F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit를 사용하면 확립된 EV marker(CD9, CD63, CD81)를 표준화되고 재현성 있게 표지(Labeling) 할 수 있어 측정 전반에 걸쳐 소포 하위 집단을 일관되게 식별할 수 있습니다. 대체 기술과 비교했을 때, 형광 NTA는 직접적인 입자 크기 측정 및 절대 농도 측정과 분자 특이성을 결합한 장점을 제공합니다. 유세포 분석법(Flow Cytometry)과 가변 저항 펄스 감지법(TRPS)은 상호 보완적인 강점을 제공하지만, 형광 NTA는 동일한 분석 워크플로우 내에서 전체 입자와 표지 된 EV 비율을 신속하고 정량적으로 비교할 수 있습니다.

전반적으로, 형광 NTA는 EV 순도 평가를 위한 실용적이고 효율적인 접근 방식을 제공하여 분리 프로토콜 최적화 및 EV 제제의 일상적인 품질 관리를 지원합니다.

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결론

 

ZetaView® 시스템을 이용한 형광 나노입자추적 분석법(F-NTA)은 입자 크기, 절대 농도, 그리고 소포 특이적 형광 검출을 원클릭(1-Click)으로 측정하여 EV 순도를 신속하고 정량적으로 평가할 수 있습니다. 유세포 분석(Flow Cytometry)과 가변 저항 펄스 센싱(TRPS)은 EV 특성 분석에 상호 보완적인 정보를 제공하지만, 형광 나노입자추적 분석(F-NTA)은 보다 신속하게 전체 입자 수와 소포 특이적 하위 집단을 직접 비교할 수 있다는 점에서 독보적입니다. 표준화된 테트라스파닌 항체 키트를 사용하면 EV를 재현성 있게 식별할 수 있으므로, 형광 나노입자추적분석(Fluorescence Nano particle Tracking Analysis)은 EV 연구, 방법 개발 및 일상적인 품질 관리에 실용적인 접근 방식입니다.