F-NTA & Western Blotting

 

F-NTA & Western Blotting

형광 NTA 분석 및 웨스턴블롯팅

 

[Zetaview 관련 논문]

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

고속 형광 나노 입자 추적 분석법을 통한 인간 혈액 내 단일 세포 외 소포의 특성화

 

Andreas Weber1, Julia Christin Wehmeyer1, Vera Schmidt1, Artur Lichtenberg1, Payam Akhyari1

1Department of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

 

[출처] https://www.jove.com/t/58731/rapid-fluorescence-based-characterization-single-extracellular

 

요약

 

이 프로토콜에서, 우리는 인간 전혈에서 세포 외 소포을 신속하게 분리하고 형광 나노 입자 추적 분석(F-NTA)에 의한 특정 마커의 특성화에 대한 완전한 작업 흐름을 설명합니다.

분석된 결과는 높은 수준의 재현성을 보여주며 이는 세포 배양 상층액의 상태에 의해 결정될 수 있습니다.

 

 

초록

 

엑소좀을 포함한 세포 외 소포(EVs)은 체액에서 발견되는 특징적인 나노 크기의 소포로서, 많은 유형의 세포에서 항상 방출되며 세포-세포 통신과 다양한 생물학적 과정을 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다.

EVs의 특성화를 위한 많은 다양한 방법이 있으나 이러한 방법의 대부분은 샘플의 준비 및 분석 준비 시간이 매우 많이 필요하거나, 크기가 이산 모집단의 부족으로 인해 관심 있는 특정 마커를 분석하기가 매우 어렵다는 단점이 있습니다.

EVs 분석 방법은 지난 10년 동안 상당히 개선되었지만 단일 EV의 특성화에 대한 표준화된 방법은 아직 없습니다. 여기서는 형광 기반 나노 입자 추적 분석을 통해 단일 EV의 특성화를 위한 반자동 방법을 시연합니다.

제시된 프로토콜은 이 분야에서 많은 연구자들의 공통적인 문제를 다루고 일반 세포막 링커인 PKH67뿐만 아니라 CD63, CD9, Vimentin(비멘틴), 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP-1)과 같은 특정 표면 마커를 사용하여 EV의 신속한 분리 및 특성화를 위한 전체 실험법을 제공합니다.

제시된 결과는 Western blotting과 같은 다른 방법으로 확인된 높은 수준의 재현성을 보여줍니다.

수행된 실험에서는 인간 혈청 샘플로부터 분리된 EV만을 사용했지만, 이 방법은 혈장이나 다른 체액에도 적합하며 세포 배양 상층액에서 EVs의 특성에 맞게 조정할 수 있습니다.

EV 생물학에 대한 연구의 향후 진행과 관계없이, 여기에 제시된 프로토콜은 특정 마커를 가진 단일 EV의 신속한 특성화를 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

프로토콜에서, 우리는 인간 전혈에서 세포 외 소포를 신속하게 분리하고 형광 나노 입자 추적 분석(F-NTA, Zetaview®)에 의한 특정 마커의 특성화에 대한 완전한 작업 흐름을 설명합니다.

 

실험 예시

 

       그림 4 : Alexa Fluor 488 Labeling된 CD9, CD63 및 비Vimentin(비멘틴)으로 염색한 후의 대표적인 결과

        ① Zetaview® F-NTA소프트웨어의 Number of particles vs Sensitivity 기능

        ② Zetaview® F-NTA소프트웨어의 Live View Screen 화면

        ③ Zetaview® F-NTA소프트웨어의 입자 크기 분포 곡선

        ④ Western Blots : CD9 (24-27kDa, A), CD63 (26kDa, B) 및 Vimentin (54kDa, C).

 

증가하는 카메라 민감도, sensitivity(x 축)에 따른 입자 신호의 늦은 발생은 웨스턴 블롯 분석에서 낮은 신호 강도와 연관되어 각 입자 표면 Marker(예 : Vimentin vs CD63)의 양이 더 적음을 확인합니다. 높은 재현성(그림4. ③)을 나타내는 분석된 모든 Markers에 대한 대표적인 분석 결과가 거의 동일한 곡선임을 알 수 있습니다.

 

결론적으로 Western Blotting 결과와 형광 NTA 분석 결과의 동일성을 활인할 수 있 수 있으며, 보다 빠르고 편리하며 정확한 분석은 ParticleMetrix사의 Zetaview® 형광 나노입자추적분석기를 통해 수행할 수 있음을 알 수 있습니다.

 

ParticleMetrix Zetaview® (PMX-120)