Zetaview를 통한 다발성 골수종 뼈 질환과 종양 발달에 역할을 하는 엑소좀 분석

Zetaview를 통한 다발성 골수종 뼈 질환과 종양 발달에 역할을 하는 엑소좀 분석

 

 

Authors: Sylvia Faict₁, Joséphine Muller₂, Kim De Veirman₁, Elke De Bruyne ₁ , Ken Maes ₁ , Louise Vrancken₂,₅, Roy Heusschen ₂, Hendrik De Raeve₃, Rik Schots₄, Karin Vanderkerken ₁ , Jo Caers ₂,₅ and Eline Menu ₁

 

이번 포스팅에서는 'Exsomes play a role in multiple myeloma bone disease and

tumor development by targeting osteocalasts and osteoblasts' 논문 중 Zetaview를

사용하여 엑소좀 입자의 크기(particle size)와 제타 전위(zeta potential) 분석을

진행한 내용을 소개드리고자 합니다.

 

엑소좀을 연구하고 품질 관리(QC)를 하려면 가장 우선 순위의 분석 장비가

NTA 분석기 (Nano particle Tracking Analyzer, 나노입자추적분석기)이며
전자동 초점,  11 position 스캐닝 분석, 제타전위 분석, 형광분석 등의 월등한

성능을 지닌 Particle Metrix사의 Zetaview를 사용하여 보다 정확하고 정밀한

NTA 분석을 하실 수 있습니다.

 

 

실험 방법:

EV의 분리 및 분석

 

5TGM1 세포를 혈청 없이 24시간 동안 배양하고 원심분리 후 조건화된 배지(CM)를

수집하고 0.22uM 기공 필터(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 여과했습니다.

여과된 배지를 150kD 단백질 농축지(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를

사용하여 농축하고 0.22uM 기공 필터로 다시 여과했습니다.

 

이 농축된 CM(CCM)에서 제조업체의 지침에 따라 ExoQuick-TC 엑소좀 침전 솔루션

(System biosciences, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 추가 필터와

최종 고속 원신분리를 추가하여 소형 EV를 분리했습니다.

오염된 세포 잔해, 단백질 밑 대형 EV를 제거하는 단계(10,000 x g, 2분)입니다.

 

ExoQuick-EV를 사용한 실험 결과는 보충 방법에 설명된 대로 Optiprep밀도 구배

초원심분리에 의해 분리된 sEV로 확인되었습니다.

 

EV 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석(Pierce BCA Protein Assay, 

Thermo Scientific)에 의해 결정되었습니다.

 

EV의 크기와 수는 Zetaview(Particle Metrix GmbH, Germany)에 의해

결정되었으며, 평균 크기와 수는 나노입자 추적 분석을 사용하여

11개의 독립적인 반복 실험에서 계산되었습니다.

 

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결과 :

5TGM1 세포빡 소포체의 특성 규명

 

우리는 먼저 5T33MMvt 및 5TGM1 세포의 조절 배지에서 나노 입자 추적

분석에 의해 결정된 약 114nm 크기의 소형 EV를 분리했습니다 (그림 1a).

그림 1b는 투과 전자 현미경으로 시각화한 소포의 이중 막을 보여줍니다.

 

웨스턴 블랏을 통해 우리는 엔도솜 단백질 TSG101과 Syntenin, 테스라스파닌

CD63과 CD81의 존재를 확인했습니다 (그림 1c).

크기와 함께 이러한 단백질의 존재는 EV가 엔도솜 기원에서 유래되었으며

엑소좀이라고 불릴 수 있음을 나타냅니다. 15

 

 

그림 1. 세포밖소포의 특성화 a. 분리된 세포밖소포를 Zetaview 나노입자추적분석기로

분리한 결과는 114.4nm의 평균 크기, 최대 크기 153nm 및 제타전위는 약 -35mV의

음성임을 보여줍니다. Polystyrene 100nm 표준 샘플을 통해 분석 전 자동 보정 후

분석한 결과이며, 샘플 셀 안의 11군데 지점을 스캐닝한 결과입니다.